Kromatografi, Kolom dan Lapis Tipis

Pada isolasi kurkumin dari kunyit dapat dilakukan kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis terhadap kurkumin. Hal yang pertama dilakukan adalah melarutkan 20 gram rimpang kunyit kering dengan diklorometana kemudian direfluks selama 1 jam. Hal ini dimaksudkan agar senyawa-senyawa kurkumin dalam kunyit tersebut benar-benar larut dalam pelarutnya. Kemudian antara filtrat dan residunya dipisahkan dengan penyaringan vakum. Filtrat (ekstrak kurkumin) ini mengandung senyawa-senyawa kurkumin. Diklorometana digunakan untuk melarutkan karena hal – hal berikut:

1. Kelarutan yang tinggi
2. Cepat menguap
3. Selektif
4. Toksisitas rendah
5. Tidak mudah terbakar
6. Murah mudah didapat

Setelah didapat filtrat (ekstrak kurkumin), kromatografi dapat dilakukan terhadap ekstrak kurkumin tersebut. Kromatografi adalah cara pemisahan dua atau lebih senyawa atau ion berdasarkan perbedaan migrasi dan distribusi senyawa atau ion-ion tersebut di dalam dua fasa yang berbeda. Dua fasa tersebut adalah

a. Fasa Diam

Merupakan fasa yang tidak bergerak. Umumnya senyawa yang digunakan adalah silica gel (SiO2) dan alumina (Al2O3).

b. Fasa Gerak

Merupakan fasa yang bergerak melalui fasa diam dan membawa komponen-komponen yang akan dipisahkan. Fasa gerak yang digunakan adalah suatu pelarut organik atau campuran beberapa pelarut organik.

Macam-macam kromatografi,

a. Kromatografi Lapis Tipis

Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.

b. Kromatografi Penukar Ion

Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik dengan sifat penukar ion sebelum perang Dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah jarangdan asam amino.

c. Kromatografi Penyaringan Gel

Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.

d. Elektroforesis

Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.

e. Kromatografi Kertas

Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi sutu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.

Keakuratan hasil pemisahan dengan metode kromatografi bergantung pada beberapa faktor berikut:

1. Pemilihan adsorben sebagai fasa diam
2. Kepolaran pelarut atau pemilihan pelarut yang sesuai sebagai fasa gerak
3. Ukuran kolom (panjang dan diameter) relatif terhadap jumlahmaterial yang akan dipisahkan
4. Laju elusi atau aliran fasa gerak

Semua jenis kromatografi melibatkan proses kesetimbangan molekul-molekul yang dinamis dan cepat diantara dua fasa. Kesetimbangan tersebut bergantung pada:

* Kepolaran dan ukuran molekul yang akan dipisahkan
* Kepolaran fasa diam
* Kepolaran fasa gerak

Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen kurkumin dari campurannya. Pada kromatogarfi kolom digunakan kolom dengan adsorben sillika gel karena kolom yang dibentuk dengan silika gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel memadat dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silika gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal.

Silica gel ada 2 macam:

1. GF245, dengan G melambangkan gypsum (CaSO4), F melambangkan floroscene, dan angka 245 menunjukkan besarnya panjang gelombang yaitu, 245 nm. Silika jenis ini sering digunakan pada kromatografi lapis tipis (TLC).
2. H, dengan tanpa adanya gypsum dan floroscene. Silika jenis ini biasa digunakan pada kromatografi kolom.

Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen di permukaannya, karena pada permukaannya terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica gel sifatnya sangat polar. Sementara itu, fasa gerak yang digunakan (dalam percobaan ini, CH2Cl2 : CH3OH = 99 : 1) sifatnya non-polar. Maka pada saat campuran dimasukkan, senyawa-senyawa yang semakin polar akan semakin lama tertahan di fasa stasioner, dan senyawa-senyawa yang semakin tidak (kurang) polar akan terbawa keluar kolom lebih cepat.

Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan :

a. Kromatografi fase normal

Kromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya “normal” bersifat polar, misalnya silica gel, sedangkan fase geraknya bersifat non polar.

b. Kromatografi fas terbalik

Kromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.

Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom.

Senyawa kurkumin dapat mengalami penurunan dengan lepasnya gugus –OCH3 dalam setiap penurunan. Kurkumin akan mengalami dua kali penurunan, dimana turunan pertamanya adalah demetoksi kurkumin dan turunan keduanya adalah bis-demetoksi kurkumin. Kurkumin akan terelusi paling akhir (berada paling bawah) karena sifatnya yang polar. Perlu diingat bahwa penurunan ini tak mungkin terjadi dengan hanya dengan melakukan kromatografi, tp ada perlakuan khususnya. Ketika senyawa kurkumin telah mengalami degradasi, akan menjadi senyawa demetoksi kurkumin (terdapat pada bagian tengah) yang lebih polar dari kurkumin. Karena telah kehilangan sebuah gugus –OCH3. Senyawa ini merupakan turunan kedua dari senyawa kurkumin. Karena tidak lagi mengandung gugus –OCH3, maka senyawa ini merupakan senyawa yang bersifat paling polar dari antara ketiga jenis senyawa kurkumin. Dengan begitu, senyawa ini akan terelusi terlebih dahulu (berada pada lapisan yang paling atas) karena fasa diam yang digunakan (silica gel) bersifat polar.

Apabila kita menggunakan kromatografi lapis tipis, dapat diperoleh dengan adanya 3 titik – titik pada pelat TLC. Hal ini menunjukkan adanya 3 komponen utama yang terkandung dalam senyawa kurkumin yang di-refluksi. Adapun 3 komponen utama tersebut adalah senyawa-senyawa kurkuminoid yaitu kurkumin (diferuloylmethane), demetoksikurkumin (hydroxycinnamoyl feruloylmethane) & bis-demetoksikurkumin (dihydroxydicinnamoyl methane).

Setelah daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf. Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.